Prije eksperimenta, sve reagense i uzorke treba uravnotežiti na sobnu temperaturu; nakon ponovnog topljenja, uzorke treba ponovno centrifugirati i uzeti supernatant za ispitivanje; za reagense ili pripremu uzorka, miješajte i izbjegavajte stvaranje pjene; kalibracija i uzorci se preporučuju za dvostruko testiranje.

1. Dodavanje: dodajte standardnu ​​radnu otopinu u prve dvije jažice redom i dodajte dvije rupe za svaku koncentraciju radne otopine, 100 μ L svakog bunara. Uzorci koji se testiraju dodaju se u druge jažice, 100 μ L po jažici (za koncentraciju uzorka iznad raspona ispitivanja, uzorak razrijeđen standardom i razrjeđenjima uzorka). Mikroploča je presvučena filmom i inkubirana na 37°C ℃ 90 min. Savjet: Kada dodajete uzorak na dno mikropločice, pokušajte ne dodirivati ​​stijenku rupe, lagano protresite i miješajte kako biste izbjegli stvaranje mjehurića. Dodatno vrijeme treba kontrolirati unutar 10 minuta.

2. Biotinilirano antitijelo/antigen: odbacite tekućinu i protresite na suho, bez ispiranja. 100 μL radne otopine biotiniliranog antitijela/antigena odmah je dodano u svaku jažicu, pomiješano, mikroploča plus film obložena i inkubirano na 37 ℃ 1 sat.

3. Ispiranje: protresite tekućinu u rupici, dodajte 350 μL tekućine za pranje u svaku jažicu, namačite 1-2 minute, usišite ili otresite tekućinu u mikroploču i osušite na debelom upijajućem papiru. Ponovite ovaj korak za pranje ploče 3 puta. Savjet: Perilica se može koristiti ovdje i u drugim koracima pranja. Svaki korak pranja bitan je za eksperiment.

4. HRP enzimski konjugat: 100 μ L radne otopine enzimskog konjugata po jažici, pomiješano, obloženo filmom i inkubirano na 37 ℃ 30 minuta.

5. Pranje: bacite tekućinu u jažicu i operite ploču 5 puta na isti način kao u koraku 3.

6. Supstrat: dodajte 90 μL otopine supstrata (TMB) u svaku jažicu, dobro promiješajte, dodajte filmsku prevlaku i inkubirajte na 37 ℃ oko 15 minuta. Napomena: Vrijeme inkubacije treba skratiti ili produljiti u skladu sa stvarnom situacijom razvoja boje, ali ne dulje od 30 minuta. Može se prekinuti kada se u standardnoj rupi pojavi jasan gradijent.

7. Raskid: Dodajte 50 μ L otopine za prekid u svaku jažicu da se prekine reakcija. Napomena: redoslijed dodavanja otopine za završetak trebao bi biti isti kao onaj za otopinu supstrata.

8. Čitanje: Čitačem mikropločica odmah izmjerite optičku gustoću (OD) svake jažice na 450 nm. Čitač mikropločica treba otvoriti unaprijed kako bi se odredio postupak ispitivanja.

9. Nakon eksperimenta vratite neiskorišteni reagens u hladnjak prema navedenoj temperaturi skladištenja do isteka roka trajanja.